蛋白互作|一文了解蛋白互作的研究方法

类别: 新闻资讯 日期: 2025-02-12 作者: Editor

 

关于蛋白互作的实验技术,常见的研究蛋白质之间的相互作用的方法如下:免疫共沉淀(Co-IP)、酵母双杂交、Pull-down、荧光共振能量转移(FRET)、表面等离子体共振(SPR)等等。

 

 

免疫共沉淀

 

 
 

原理

 

基于抗原-抗体特异性结合,用于研究天然状态下蛋白质相互作用的经典方法

 
 

流程

 

1.细胞裂解获取目的蛋白溶液

2.预纯化与抗体孵育

3.免疫沉淀富集蛋白与洗杂

4.洗脱互作复合体与分析(WB或质谱检测)

 
 

优点

 

生理条件下检测内源性互作真实可靠,可分离多组分蛋白复合物

 
 

局限

 

灵敏度限制可能无法检测低亲和力或瞬时的相互作用,需高质量抗体,可能产生假阳性,裂解条件需优化以避免破坏互作

 

 

Pull-down 实验

 

 
 

原理

 

重组蛋白(如GST标签蛋白)作为”诱饵”捕获结合蛋白

 
 

类型

 

1.GST Pull-down          2.His标签Pull-down

 
 

优点

 

验证体外直接相互作用

 
 

局限

 

有活性的目的蛋白难表达获得,不是生理条件下检测可能存在假阴性

 

 

酵母双杂交系统

 

 
 

原理

 

转录因子拆分后通过蛋白互作重建活性

 
 

优点

 

高通量筛选互作蛋白

 
 

局限

 

限于核内蛋白,存在假阳性/阴性

 

 

荧光共振能量转移(FRET)

 

 
 

原理

 

荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是一种基于非辐射能量传递的分子间相互作用检测技术,需荧光标记蛋白

 
 

优点

 

可检测距离<10nm的相互作用,可实时观测活细胞动态,无需破碎细胞,保留天然构象与翻译后修饰状态

 
 

局限

 

供受体发射光谱重叠导致假阳性,结果受表达水平、局部pH等因素影响,荧光蛋白体积可能干扰目标蛋白功能  

 

 

生物膜干涉技术(BLI)

 

 
 

原理

 

基于白光干涉原理,通过检测传感器表面生物膜层厚度变化来实时监测分子相互作用

 
 

优点

 

无需荧光/同位素标记,保留分子天然构象,可定量分析结合动力学,可直接检测粗提液、血清等复杂样本

 
 

局限

 

小分子(<150Da)信号较弱,需高浓度样本,抗原多聚化导致假阳性(如三明治法需单体抗原),固相化可能改变配体构象,专用传感器耗材价格较高

 

 

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