
关于蛋白互作的实验技术,常见的研究蛋白质之间的相互作用的方法如下:免疫共沉淀(Co-IP)、酵母双杂交、Pull-down、荧光共振能量转移(FRET)、表面等离子体共振(SPR)等等。
免疫共沉淀
原理
基于抗原-抗体特异性结合,用于研究天然状态下蛋白质相互作用的经典方法
流程
1.细胞裂解获取目的蛋白溶液
2.预纯化与抗体孵育
3.免疫沉淀富集蛋白与洗杂
4.洗脱互作复合体与分析(WB或质谱检测)
优点
生理条件下检测内源性互作,真实可靠,可分离多组分蛋白复合物
局限
灵敏度限制可能无法检测低亲和力或瞬时的相互作用,需高质量抗体,可能产生假阳性,裂解条件需优化以避免破坏互作
Pull-down 实验
原理
重组蛋白(如GST标签蛋白)作为”诱饵”捕获结合蛋白
类型
1.GST Pull-down 2.His标签Pull-down
优点
验证体外直接相互作用
局限
有活性的目的蛋白难表达获得,不是生理条件下检测可能存在假阴性
酵母双杂交系统
原理
转录因子拆分后通过蛋白互作重建活性
优点
高通量筛选互作蛋白
局限
限于核内蛋白,存在假阳性/阴性
荧光共振能量转移(FRET)
原理
荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是一种基于非辐射能量传递的分子间相互作用检测技术,需荧光标记蛋白
优点
可检测距离<10nm的相互作用,可实时观测活细胞动态,无需破碎细胞,保留天然构象与翻译后修饰状态
局限
供受体发射光谱重叠导致假阳性,结果受表达水平、局部pH等因素影响,荧光蛋白体积可能干扰目标蛋白功能
生物膜干涉技术(BLI)
原理
基于白光干涉原理,通过检测传感器表面生物膜层厚度变化来实时监测分子相互作用
优点
无需荧光/同位素标记,保留分子天然构象,可定量分析结合动力学,可直接检测粗提液、血清等复杂样本
局限
小分子(<150Da)信号较弱,需高浓度样本,抗原多聚化导致假阳性(如三明治法需单体抗原),固相化可能改变配体构象,专用传感器耗材价格较高
新的一年
乐七生物携手
Co-IP与Pulldown全序列beads
磁珠产品以及试剂盒产品
开启新征程
欢迎广大新老客户咨询选购
手机扫码可直接访问该页面