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免疫共沉淀（Co-IP）是一种基于抗原-抗体特异性结合的蛋白质相互作用研究方法，适用于天然状态下蛋白质复合体的验证。
实验原理
01
非变性裂解
使用温和裂解缓冲液（如含1% NP-40或Triton X-100的RIPA缓冲液），保留细胞内蛋白质的天然构象及相互作用。
注：裂解液中需添加蛋白酶抑制剂（如PMSF）防止蛋白降解。
02
抗体靶向捕获
特异性抗体与目标蛋白（如蛋白X）结合后，通过Protein A/G微珠（如琼脂糖珠或磁珠）沉淀抗原-抗体复合物，可让目标蛋白的互作结合蛋白Y会随复合物一同沉淀富集，得到共分离的蛋白样本。
03
复合物检测
通过Western Blot或质谱（MS）分析沉淀物中的蛋白组分，验证相互作用。
结果示例：
关键特点
检测内源性相互作用（无需外源表达）；
保留蛋白质翻译后修饰状态；
可捕获多蛋白复合物。
操作流程
（以哺乳动物细胞为例）
实验前准备
实验步骤
细胞裂解
01
收集细胞（约1×10⁷个），加入0.5-1ml预冷裂解液，冰上孵育30分钟(注意每10min混匀一次保证细胞充分裂解)，4℃ 12,000g离心15分钟，取上清。
02
预清除(可选)
加入20-30μl Protein A/G珠，4℃旋转孵育1小时，离心去除非特异结合蛋白（减少背景）。
抗体孵育
03
加入1-5μg特异性抗体，4℃缓慢旋转孵育2-4h。
04
复合物沉淀
加入30-50μl预处理过的Protein A/G珠，4℃旋转孵育2-4小时。
洗涤
05
离心（3,000rpm，3分钟）收集珠子，用预冷裂解液洗涤3次（每次1ml），去除非特异吸附。
06
洗脱与检测
加入2×SDS上样缓冲液或者Elution buffer洗脱，煮沸5分钟，离心后取上清进行WB或质谱分析。
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