品名：BCA蛋白浓度测定试剂盒

货号：YSD-500T

规格：500T

➽试剂盒组分

➽工作原理

碱性条件下，蛋白将二价Cu离子还原为一价Cu离子，一价Cu离子与BCA试剂形成紫颜色的络合物，吸光度强度与蛋白浓度程正比。测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算出待测液体的蛋白浓度。

➽试剂盒性能：

• 准确灵敏，线性范围广，BCA试剂的蛋白测定范围是20-2000ug/ml；
• 快速：45分钟内完成测定；
• 经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量；
• 稳定：不受样品中离子型和非离子性去污剂影响；
• 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

➽注意事项：

1.低温或长期保存，若发现BCA试剂中A或者B试剂有沉淀发生，请于37℃恒温并搅拌促使其充分溶解，若发现细菌污染（如出现不可溶解的絮状物或沉淀）则应丢弃，避免对实验结果造成影响；

2.不受大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20/60/80等；

3.每次测量蛋白浓度均应做标准曲线；

4.当试剂A或者B混合时出现浑浊，请充分混匀，浑浊即会消失；

5.需准备37℃水浴或恒温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为562nm（540-595nm之间皆可）；

6.使用BCA蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且

显色反应的速度和温度有关，因此需要注意检测时需要保持定时和定温，以确保测量数值的精确；（37℃ 30min/室温 2h）

7.实验操作规范，提高上样量的精确度。

➽使用方法：

• 配制BSA标准品

注：标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品的基质溶液应与稀释液保持一直，也可用0.9%的NaCl或0.01M PBS进行稀释。

先将标准品稀释至2mg/ml（操作如：120ul BSA（5mg/ml）+180ul稀释液=300ul BSA溶液（2mg/ml）

BSA标准品配制可参考下表（微孔板检测，线性范围20-2000ug/ml）

BSA标准品配制可参考下表（试管法检测，线性范围20-2000ug/ml）

2. 配制BCA工作液

（1）配制BCA工作液

按照50:1的比例混合试剂A和试剂B（A：50，B：1），充分混匀

（2）计算所需要的总BCA工作液体积

BCA工作液体积=（标准品+待测样品）*重复孔数*每个样品所需BCA体积

注意事项：试管法检测时每个样品加2.0ml BCA工作液，微孔板检测每个样品加200ul BCA工作液。

➽实验步骤：

试管法（样品：BCA工作液=1:20）

1.各取100ul标准品梯度溶液和待测样品加入到反应管中；

2.每管加入2.0ml的BCA 工作液，混匀，37℃孵育30分钟；

注意：也可室温孵育2小时，或60℃孵育30分钟。BCA检测蛋白浓度，延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和时间延长会降低检测下限，以及降低工作线性范围。

3.冷却至室温，在分光光度计上进行检测，设定波长为562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。然后在10分钟内完成对所有样品的判读。

注意：由于BCA反应无真正的反应终点，即时温度下降低至室温，生色反应还是会继续。但是，由于室温下生色比率相对很低，因此若是10分钟内能对所有样品进行562nm的吸光度测试，不会导致明显误差。

4.根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中0值的OD值即为最终的读数），绘制标准曲线（蛋白浓度ug/ml，为x值；吸光度OD_562nm为Y值），依据标准曲线和样品的稀释倍数计算出样品中蛋白浓度。

微孔板法（样品：BCA工作液=1:10）

1.如表，将BSA标准品（2mg/ml）添加入微孔板中，再用稀释液补足至20ul；

2.取20ul样品加入反应孔中（建议未知样品，利用稀释液稀释几个梯度）；

3.将BCA工作液按照200ul孔加入各个反应孔中，封膜，放置合适环境进行反应（37℃或60℃反应30min；室温反应2h）

4. 冷却至室温，在酶标仪的540～595nm波长范围内检测吸光度，其中562nm波长最佳；

5. 根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中Blank孔的OD值即为最终的读数）。绘制标准曲线（蛋白浓度ug/ml，为x值；吸光度OD_562nm为Y值），依据标准曲线和样品的稀释倍数计算出样品中蛋白浓度。

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